GC-MS, GC-FID ve HPLC

Bir ekstraktın analiz sertifikasında (CoA, bir partinin ölçüm sonuçlarını veren belge) üç kısaltma sık görülür: GC-MS, GC-FID, HPLC. Üçü de kromatografi yöntemidir. Kromatografi karışımı bileşenlerine ayırır. Üçünün işi farklıdır. GC-MS bir bileşenin ne olduğunu söyler. GC-FID uçucu bileşenlerin ne kadar olduğunu ölçer. HPLC uçmayan etkin maddelerin ne kadar olduğunu ölçer. Sertifikadaki yüzdenin ne anlama geldiği, hangi yöntemle alındığına bağlıdır.

Kromatografi ne yapar?

Kromatografi karışımı bileşenlerine ayırır ve her bileşeni bir tepe olarak çizer. Numune ince uzun bir kolondan (ayırma borusu) geçirilir. Her bileşen kolonda farklı hızda ilerler ve farklı zamanda çıkar. Çıkıştaki dedektör (kolondan çıkanı algılayan parça) her bileşeni bir tepe olarak kaydeder. Bu tepeye pik denir. Pikin çıkış zamanı hangi madde olduğuna ipucu verir. Pikin alanı ne kadar olduğunu söyler.

Gaz kromatografisi (GC) uçucu maddeler içindir. Numune ısıtılıp buharlaştırılır ve bir gazla kolona taşınır. Uçucu yağlar, CO₂ ekstraktının kokulu ve uçucu kısmı olan uçucu fraksiyon ve terpenler (çam, narenciye, lavanta kokusunu veren molekül ailesi) bu yolla ölçülür. Uçucu yağ analizinde ayırma işini GC yapar. Tanıma için ona çoğu zaman kütle spektrometresi (bileşeni tanıyan ikinci cihaz) eklenir [1].

Sıvı kromatografisi (HPLC) uçmayan maddeler içindir. Numune bir çözücüde çözülür ve basınçla kolondan pompalanır. Isıtınca buharlaşmayan ya da bozunan maddeler bu yolla ölçülür: piperin, gingerol, kapsaisinoid, karnosik asit.

Kısaltmanın ilk parçası ayırma yöntemini söyler, GC ya da HPLC. GC'nin yanındaki ikinci parça dedektörü söyler. MS tanır, FID ölçer. HPLC sertifikada çoğu zaman tek başına yazılır.

GC-MS neyi kanıtlar?

GC-MS bileşenin kimliğini kanıtlar. Kütle spektrometresi (MS) her piki parçalara ayırır ve parçalanma desenini kaydeder. Bu desen molekülün parmak izi gibidir. Cihaz deseni bir kütüphaneyle (kayıtlı desenler listesi) karşılaştırır ve en yakın eşleşmeyi verir. Sertifikadaki pik listesi böyle yazılır: "linalool", "limonen", "karvakrol".

Kimlik iki ölçütle verilir: kütüphane eşleşmesi ve pikin çıkış zamanı. Kütüphanedeki desenler farklı koşullarda kaydedilmiştir ve birbirine benzeyen terpenler aynı deseni verebilir. Bir uçucu yağ çalışması bu yüzden kütüphaneyi tek ölçüt saymaz, kimliği alıkonma indisiyle birlikte verir [2]. Alıkonma indisi pikin çıkış zamanının cihazdan bağımsız, kıyaslanabilir bir sayıya çevrilmiş hâlidir. Laboratuvarlar arası kıyasa izin verir ve kimliği doğrulamanın tamamlayıcı bilgisidir [3]. Ayrıntılı raporda bileşen adının yanında alıkonma indisi de yazar.

GC-MS miktarı kanıtlamaz. MS dedektörü her maddeye farklı tepki verir. Pik alanından yazılan yüzde bu yüzden yaklaşık bir değerdir. Kısa kural şudur: GC-MS tanır, GC-FID ölçer.

GC-FID neyi kanıtlar?

GC-FID uçucu bileşenlerin miktarını kanıtlar. Alev iyonlaşma dedektörü (FID) kolondan çıkan maddeyi hidrojen alevinde yakar ve oluşan akımı ölçer. Tepki maddeden maddeye az değişir. Yanma ısısıyla ilişkilidir ve molekül formülünden tahmin edilebilir [4], [5]. MS'te bu fark büyüktür. Bu yüzden FID pik alanı gerçek orana yakındır, MS pik alanı değildir.

Uçucu yağ sertifikasındaki yüzde çoğu zaman alan yüzdesidir. Bütün piklerin alanı toplanır, her pik toplamın yüzdesi olarak yazılır. Bu hesap her maddenin aynı tepkiyi verdiğini varsayar. Sonuç gerçek orana yakındır, eşit değildir. Uçucu yağ ölçümünde alan yüzdesinden kalibrasyonla (cihazı bilinen miktarlarla ayarlama) bulunan gerçek miktara kadar birkaç yol vardır. Her yolun kendi alanı ve sınırı vardır [6]. Alan yüzdesi hızlıdır ve aynı yağın partilerini kıyaslamaya yeter. Ağırlık yüzdesi (100 gramda kaç gram) için referans madde (saf ve miktarı bilinen karşılaştırma maddesi) ya da iç standart (numuneye bilinen miktarda katılan karşılaştırma maddesi) gerekir. Formül hesabı ağırlık yüzdesiyle yapılır.

Sertifikada iki yazım görülür. "Area %" ya da "% (GC-FID, normalised)" alan yüzdesidir, normalised toplamın 100'e tamamlandığını söyler. "w/w %" ya da "g/100 g" ağırlık yüzdesidir. İkisi aynı yağda farklı sayı verebilir. Uçucu yağ standartları (ISO) bileşen aralıklarını GC ile verir [7]. Sertifikada aralık ve yöntem birlikte okunur.

Yağ asitleri de GC-FID ile ölçülür. Sabit yağ ve tohum yağı ekstraktının "yağ asidi profili" satırı böyle gelir. Yağ asitleri uçucu değildir. Ölçümden önce kimyasal olarak buharlaşabilen bir biçime (metil esteri) çevrilir. Sonuç toplam yağ asitlerinin yüzdesi olarak yazılır, ürünün ağırlık yüzdesi olarak değil.

HPLC neyi kanıtlar?

HPLC uçmayan etkin maddenin ağırlık yüzdesini kanıtlar. Cihaz saf ve miktarı bilinen bir referans maddeyle ayarlanır. Numunenin piki onunla karşılaştırılır ve sonuç ağırlık yüzdesi (gerçek içerik) olur. Dedektör çoğu zaman morötesi (UV) ışık soğurmasıdır, DAD aynı ailenin bir üyesidir. "Piperin 27,4 % (HPLC)" gibi bir satır ölçülen ağırlık yüzdesidir, alan yüzdesi değil. Rakam örnektir.

Sık alınan ekstraktlar için resmî HPLC yöntemleri vardır. Zencefil için Amerikan Farmakopesi (USP) ve ISO yöntemleri vardır [8]. Zerdeçal için AOAC (uluslararası analitik yöntem birliği) yöntemi üç kurkuminoidi ayrı ayrı ölçer [9].

Sertifikadaki satır tek bileşeni ya da toplamı verir. HPLC akraba bileşenleri ayrı piklere ayırır. Acı biberde kapsaisinoidler bir ailedir ve iki ana üye kapsaisin ile dihidrokapsaisindir [10]. "Toplam kapsaisinoid" satırı ile "kapsaisin" satırı aynı sayı değildir. Kurkuminoid, gingerol ve tokoferol için de aynı soru sorulur. Örnek için bakınız: piperin, gingerol, kapsaisinoid, karnosik asit, tokoferol.

Hiçbiri neyi kanıtlamaz?

Kromatografi kökeni kanıtlamaz. Bir pikin hangi molekül olduğunu söyler, nereden geldiğini söylemez. Köken için aynı molekülün sağ ve sol el biçimlerinin (enantiyomer) oranına bakılır. Bu, iki biçimi ayırabilen özel kolonlu GC ile (kiral GC) yapılan ayrı bir testtir [7].

Kirleticileri kanıtlamaz. Ağır metal, pestisit ve mikrop ayrı cihaz ve ayrı yöntemlerle ölçülür. Sertifikada ayrı satırlardır. Çözücü kalıntısı da ayrı bir GC yöntemiyle, numunenin üstündeki buhardan (headspace) ölçülür. Ne kalabileceği ayrı sayfada anlatılır: çözücü kalıntısı.

Sertifikada nasıl okunur?

Spesifikasyon ile ölçüm ayrılır. Teknik veri sayfası (TDS) sınırı verir. Sertifika o partinin ölçüm günündeki sonucunu verir. Üç belgenin farkı ayrı sayfada anlatılır: TDS, SDS, CoA.