GC-MS, GC-FID и HPLC

В сертификате анализа экстракта (CoA, документе с результатами измерений конкретной партии) часто встречаются три сокращения: GC-MS, GC-FID, HPLC. Все три метода относятся к хроматографии. Хроматография разделяет смесь на компоненты. У этих трех методов разные задачи. GC-MS показывает, что это за компонент. GC-FID измеряет, сколько содержится летучих компонентов. HPLC измеряет количество нелетучих активных веществ. Значение указанного в сертификате процента зависит от того, каким методом он был получен.

Что делает хроматография?

Хроматография разделяет смесь на компоненты и отображает каждый компонент в виде вершины. Образец пропускают через длинную тонкую колонку (разделительную трубку). Каждый компонент движется по колонке с разной скоростью и выходит в разное время. Детектор на выходе (узел, фиксирующий выходящие из колонки вещества) записывает каждый компонент как вершину. Эту вершину называют пиком. Время выхода пика дает подсказку о том, какое это вещество. Площадь пика показывает его количество.

Газовая хроматография (ГХ / GC) предназначена для летучих веществ. Образец нагревают, испаряют и переносят в колонку с помощью газа. Этим способом измеряют эфирные масла, летучую фракцию (ароматную и летучую часть CO₂-экстракта) и терпены (семейство молекул, придающих аромат сосне, цитрусовым, лаванде). При анализе эфирных масел разделение выполняет GC. Для идентификации к нему чаще всего добавляют масс-спектрометрию (МС) — второй прибор, распознающий компонент [1].

Жидкостная хроматография (ВЭЖХ / HPLC) предназначена для нелетучих веществ. Образец растворяют в растворителе и под давлением прокачивают через колонку. Таким способом измеряют вещества, которые не испаряются при нагревании или разрушаются: пиперин, гингерол, капсаициноиды, карнозиновая кислота.

Первая часть аббревиатуры указывает на метод разделения: GC или HPLC. Вторая часть рядом с GC указывает на детектор. MS идентифицирует, FID измеряет. HPLC в сертификате чаще всего указывается без дополнительных обозначений.

Что доказывает GC-MS?

GC-MS доказывает идентичность компонента. Масс-спектрометр (MS) разбивает каждый пик на фрагменты и фиксирует спектр фрагментации. Этот спектр похож на отпечаток пальца молекулы. Прибор сравнивает спектр с библиотекой (списком сохраненных спектров) и выдает наиболее близкое совпадение. Так формируется список пиков в сертификате: «линалоол», «лимонен», «карвакрол».

Идентичность устанавливается по двум критериям: совпадению с библиотекой и времени выхода пика. Спектры в библиотеке записаны при различных условиях, и похожие терпены могут давать одинаковый спектр. Поэтому при исследовании эфирных масел библиотека не считается единственным критерием, а идентичность указывают вместе с индексом удерживания [2]. Индекс удерживания представляет собой время выхода пика, переведенное в сопоставимое число, не зависящее от конкретного прибора. Он позволяет проводить межлабораторные сравнения и служит дополнительным подтверждением идентичности [3]. В подробном отчете рядом с названием компонента указывается и индекс удерживания.

GC-MS не доказывает количество. Детектор MS по-разному реагирует на каждое вещество. Поэтому процент, рассчитанный по площади пика, является приблизительным значением. Простое правило: GC-MS идентифицирует, GC-FID измеряет.

Что доказывает GC-FID?

GC-FID подтверждает количество летучих компонентов. Пламенно-ионизационный детектор (ПИД / FID) сжигает выходящее из колонки вещество в водородном пламени и измеряет возникающий ток. Коэффициент отклика слабо меняется от вещества к веществу. Он связан с теплотой сгорания и может быть рассчитан по молекулярной формуле [4], [5]. В MS эта разница велика. По этой причине площадь пика FID близка к реальной доле, а площадь пика MS — нет.

Процент в сертификате эфирного масла чаще всего представляет собой процент площади (area %). Площади всех пиков суммируются, и каждый пик записывается как процент от общей суммы. Этот расчет предполагает, что каждое вещество дает одинаковый отклик. Результат близок к реальной доле, но не равен ей. При анализе эфирных масел существует несколько способов определения содержания: от процента площади до точного количества, полученного путем калибровки (настройки прибора по известным количествам). У каждого способа есть своя область применения и ограничения [6]. Процент площади определяется быстро и достаточен для сравнения партий одного и того же масла. Для массовой доли (% масс., сколько граммов в 100 граммах) требуется стандартный образец (чистое вещество сравнения с известным количеством) или внутренний стандарт (вещество сравнения, добавленное в образец в известном количестве). Расчет рецептур ведут по массовой доле.

В сертификате встречаются два варианта записи. Обозначения «Area %» или «% (GC-FID, normalised)» означают процент площади (normalised указывает на то, что сумма приведена к 100). Обозначения «w/w %» или «g/100 g» указывают на массовую долю. Для одного и того же масла эти показатели могут давать разные значения. Стандарты на эфирные масла (ISO) указывают диапазоны компонентов по данным GC [7]. В сертификате диапазон и метод следует сопоставлять вместе.

Жирные кислоты также измеряются методом GC-FID. Строка «профиль жирных кислот» для экстрактов жирных и семенных масел формируется именно так. Жирные кислоты нелетучи. Перед измерением их химически переводят в летучую форму (метиловый эфир жирной кислоты, FAME). Результат записывается как процент от общего количества жирных кислот, а не как массовая доля от массы продукта.

Что доказывает HPLC?

HPLC подтверждает массовую долю нелетучего активного вещества. Прибор калибруют по чистому стандартному образцу с известным количеством. Пик образца сравнивают со стандартом и получают результат в виде массовой доли (реального содержания). В качестве детектора чаще всего используется поглощение ультрафиолетового (УФ) излучения; детектор DAD (HPLC-DAD) относится к этому же типу. Строка вида «Пиперин 27,4 % (HPLC)» означает измеренную массовую долю, а не процент площади. Число приведено для примера.

Для часто используемых экстрактов существуют официальные методы HPLC. Для имбиря есть методы Фармакопеи США (USP) и ISO [8]. Для куркумы метод AOAC (международной ассоциации аналитических сообществ) раздельно измеряет три куркуминоида [9].

Строка в сертификате указывает отдельный компонент или их сумму. Метод HPLC разделяет родственные компоненты на отдельные пики. В остром перце капсаициноиды представляют собой группу веществ, два основных представителя которой — капсаицин и дигидрокапсаицин [10]. Строка «общие капсаициноиды» и строка «капсаицин» содержат разные числа. Тот же вопрос возникает для куркуминоидов, гингеролов и токоферолов. Примеры см. в материалах: пиперин, гингеролы, капсаициноиды, карнозиновая кислота, токоферолы.

Что не доказывает ни один из методов?

Хроматография не доказывает происхождение. Она показывает, какая именно молекула содержится в пике, но не указывает источник ее получения. Для определения происхождения смотрят на соотношение «правой» и «левой» зеркальных форм одной и той же молекулы (энантиомеров). Это отдельный тест, выполняемый методом GC со специальной колонкой (хиральная ГХ), способной разделять эти две формы [7].

Загрязнители они не определяют. Тяжелые металлы, пестициды и микробиологические показатели измеряются на других приборах и другими методами. В сертификате они вынесены в отдельные строки. Остаточные растворители также измеряются отдельным методом GC по парам над образцом (headspace). Что может остаться, описано в отдельной статье: остаточные растворители.

Как читать сертификат?

Спецификация и измерение — разные вещи. Техническая спецификация (TDS) задает предел. Сертификат содержит результаты анализа конкретной партии на дату измерения. Различия между тремя документами описаны в отдельной статье: TDS, SDS, CoA.